详细介绍水产品中孔雀石绿和结晶紫前处理试剂盒的原理

水产品中孔雀石绿和结晶紫前处理试剂盒型号：QCL2

水产品中孔雀石绿和结晶紫的快速测定方法

液相色谱-串联质谱法 依据标准（SN/T1768-2006）

1 原理

试样中残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、用孔雀石绿柱浓缩净化后用液相色谱-串联质谱进行检测，外标法定量。

2 试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。

2.1乙腈：色谱纯。

2.2无水乙酸铵。

2.3冰乙酸：色谱纯。

2.4 乙腈酸溶液：乙腈+冰乙酸（98+2，V/V）。

2.5 甲醇酸溶液：甲醇+冰乙酸（80+20，V/V）。

2.6 乙腈水溶液：乙腈+水（20+80，V/V）。

2.7 5mmol/L乙酸铵缓冲溶液：称取0.385 g无水乙酸铵，溶解于大约980 mL水中，用冰乙酸调节pH到4.5，zui后用水定容到1000 mL，过0.20 μm滤膜。

2.8标准品: 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98 %。

2.9标准贮备溶液:准确称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10mg，用乙腈分别溶解定容于100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL的标准贮备液。

2.10 混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10 μg/mL的混合标准溶液。0℃～4℃避光保存。

2.11孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒* 。

3 仪器和设备

3.1液相色谱-串联质谱联用仪:配有电喷雾(ESI)离子源。

3.2匀浆机。

3.3旋转蒸发仪。

3.4离心机：4000 r/min。

3.5振荡器。

3.6声波水浴。

3.7聚四氟乙烯离心管:2.5 mL,50 mL，带塞。

3.8微孔滤膜:0.45 μm。

4 测定步骤

4.1提取和净化

提取：准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中的提取剂1^*(液体20.0 mL)，用匀浆机以8 000 r/min的速度均质30 s，再加入提取剂2^*(固体粉末), 振荡1 min,4 000 r/min离心5 min。

净化：层析柱依次用2mL乙腈酸溶液(2.4)、5mL甲醇酸溶液（2.5）、5mL蒸馏水激活，再取上清液5mL于50mL试管中，加入10～15mL水混匀， 分次加入孔雀石绿层析柱中，用吸耳球从上口挤压加快流速或用固相萃取机从下抽真空，液体流完后加5mL乙腈水溶液（2.6）洗涤，挤干柱中液体，用 0.8mL乙腈酸溶液（2.4）洗脱，收集洗脱液，用缓冲液（2.7）定容至1mL。微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。

4.2绘制标准工作曲线

移取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫混和标准溶液，用流动相稀释成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL标准工作溶液，用液相色谱-串联质谱仪测定，得出标准工作曲线。

4.3测定

4.3.1液相色谱-串联质谱条件

a) 色谱柱：C₁₈柱，150 mm×2.1 mm(i.d.)，粒度5 μm；

b) 流动相：乙腈+5 mmol/L乙酸铵(75+25,V/V)；

c) 流速：0.2 mL/min；

d) 柱温：35℃；

e) 进样量：10 μL；

f) 离子源：电喷雾ESI，正离子；

g) 扫描方式：多反应监测MRM；

h) 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到要求；

i) 喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至*灵敏度；

j) 监测离子对：孔雀石绿m/z 329/313（定量离子）、329/208；隐色孔雀石绿m/z 331/316（定量离子）、331/239；结晶紫m/z 372/356（定量离子）、372/251；隐色结晶紫m/z 374/358（定量离子）、374/238。

4.4液相色谱-串联质谱定量测定

按照2.4.2.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，标准曲线法测定样液中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量。样品中被测物残留量应在标准曲线范围之内，如果含量出标准曲线范围，应用流动相适当稀释。在上述色谱条件下， 孔雀石绿 、结晶紫 、隐色孔雀石绿 、隐色结晶紫的保留时间约为1.89 min、5.35 min、2.47 min和5.51 min。标准溶液的液相色谱-电喷雾质量色谱图见附录B中的图B.1。

4.5液相色谱-串联质谱定性测定

按照2.4.2.1液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液，分别计算样品和标准工作溶液中两对离子对色谱峰面积的比值，仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。

4.6空白试验

除不加试样外，均按上述测定步骤进行。

5结果计算表述

按式（1）分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量，计算结果需扣除空白。

4×c_i×V

ω = 　 …… (1)

m

ω－水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫残留量，μg/kg；

c_i －标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的标准工作溶液浓度，μg/L；

V－zui终定容体积数，mL；

4－换算常数；

m－供试试料样品重量，g。

本方法分别计算孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿,并分别报告孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿结果。

本方法分别计算结晶紫及代谢物隐色结晶紫,并分别报告结晶紫及代谢物隐色结晶紫结果。

6测定低限、回收率

6.1测定低限

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测低限均为0.5 μg/kg。

6.2回收率

本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率均为:85%～105%；